意见:大流行和RNA测序差距
意见:大流行和RNA测序差距

意见:大流行和RNA测序差距

RNA测序技术远远落后于研究人员解码和理解DNA的能力。Covid-19大流行强调了这种危险的缺点。

罗伯特·罗斯
9月1日,2021年

以上:©istock.com,CROCOTHERY

T.他在全世界注意到SARS-COV-2病毒,强调了分析方法的缺乏,用于快速且经济高效的鉴定和病毒RNA表征。许多病毒家庭(包括冠状病毒),人逆转录病毒和流感等致病品种,是RNA病毒,这意味着它们的遗传物质以RNA的形式而不是DNA发生。当这些病毒感染宿主细胞时,病毒RNA包劫持受感染的细胞的分子机械,并开始产生自己的病毒分子,最终压倒细胞,释放新的病毒分子以感染系统中的其他细胞。

大约20年前,一种现在被称为SARS- cov -1的RNA病毒在人类中传播,导致近775人死于该病毒引起的严重急性呼吸系统综合症(SARS)。自2012年以来,另一种由RNA冠状病毒引起的疾病中东呼吸综合征(MERS)已导致850多人死亡,约占感染人数的35%。科学家们对这些病毒感染的严重性感到震惊,通过基因分析,他们能够了解这些病毒是如何感染细胞的。但是,rna特征技术相对于以dna为中心的方法的劣势意味着,研究人员对与这些感染相关的生物学和过程的理解仍处于襁褓之中。

RNA与DNA的不同之处在于,它是在转录后通过碱基和核糖糖上的各种化学成分进行修饰的。迄今为止,在RNA中已经检测到超过140种修饰,而在转移RNA上发现的修饰浓度最大,转移RNA在翻译过程中向核糖体传递氨基酸,每一种被研究的RNA都包含一定程度的修饰。经过70多年的研究,人们对RNA修饰的生物学作用有了一定的了解。然而,关于它们在病毒RNA中扮演的角色,我们知之甚少。从分析的角度来看,病毒RNA的研究受到许多技术挑战的阻碍,例如无法生成病毒RNA的实际序列,并在其适当的位置进行修饰。

例如,遗传序列SARS-COV-2发表于2020年。该论文的作者报告存在于病毒RNA序列中发现的41个修饰位点。由于RNA测序(RNA-SEQ)不能直接识别修改,这些修改被列为未知。RNA-SEQ酶促产生互补的DNA链(cDNA)。在创建cDNA的过程中,酶“读取”RNA在遇到修改时停止。利用这些硬盘识别识别可能存在的改性,但不是其同一性(甲基化,乙酰化等)。

这种缺失的信息至关重要,特别是在病毒RNA的背景下,由于未经血RNA中显示出修饰,以协助结构稳定性或充当RNA蛋白结合的决定因素,病毒RNA感染和复制的两个关键属性。在SARS-COV-2的背景下提出了两个立即问题:未知修改的化学结构是什么,以及它们如何为病毒的生物学作出贡献?

自1985年以来,研究RNA改性的金标准是质谱。该方法,发达在犹他大学的James McCloskey实验室中,不仅可以在存在修改的情况下,还可以说明修改以及它们在序列中存在的地方。首先,对转录组织的质谱局部的两个最大限制是对大型样品的需要,其次是电离低效率。在完全表征所需的浓度下不能经济地纯化病毒RNA。此外,由于电喷雾电离的性质,不能容易地分析大分子,例如完整的mRNA;分子越大越难以完全电离并在用于将改性映射到其序列内的各自位置的碎片过程中的电荷越难。然而,质谱仍然是直接序列RNA的唯一方法。

纳米孔测序等较新技术提供了能够处理小型样品的承诺,也能够读取和定位RNA修饰。纳米孔测序与标准RNA-SEQ的不同之处在于RNA转录物通过圆形蛋白质复合物进料。当核碱基通过孔时,可以检测电信号并转换为序列ID。直接读取RNA,无需产生cDNA。纳米孔测序的限制是需要训练系统以识别每个RNA改性的签名。这成为静脉的任务,因为每个核苷酸的电签名受其邻近核苷酸的影响。与所有相邻核苷酸的所有修饰产生培训库相关的时间和成本是令人禁止的。

我们被告知下一个大流行就在拐角处。如果是这种情况,则需要另一种空间赛跑型努力,这次具有开发方法可以更充分地表征RNA而不是飞向月球的方法。

罗伯特·罗斯Thermo Fisher Scientific是高级产品应用专家,致力于液相色谱串联质谱(LC-MS / MS)表征核酸的发展。给他发电子邮件robert.ross2@thermofisher.com